Luminex xPONENT - Manuale (Pagina 16)

Manuale del software Luminex xPONENT
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Misurazioni ripetitive di
granuli xMAP
In un'analisi xMAP, il segnale reporter rappresenta il risultato
dell'analisi. A causa delle dimensioni ridotte dei granuli, una
sospensione di granuli xMAP presenta una cinetica di reazione
vicina alla fase di soluzione. Ciò significa che ciascun set di granuli
xMAP utilizzato per una particolare analisi mostrerà una
distribuzione statisticamente uniforme di molecole reporter legate
alla superficie di ciascun granulo. Durante l'acquisizione dati,
vengono analizzati numerosi granuli di ciascun gruppo e il software
calcola la statistica mediana di quel gruppo. Quanti più granuli di un
gruppo vengono misurati, maggiore è l'affidabilità di quella
particolare misurazione.
Classificazione e
fluorocromi reporter
Ciascun set di granuli xMAP è colorato internamente con due
coloranti di classificazione. Il segnale di fluorescenza di questi due
coloranti consente la classificazione di ciascun set di granuli. Poiché
ciascun granulo viene analizzato singolarmente, anche quando i
gruppi sono mescolati in un'analisi multiplex possono essere ancora
distinti tramite i loro segnali di emissione. Il segnale di fluorescenza
delle molecole reporter legate alla superficie di ciascun set di granuli
viene misurato e utilizzato per determinare il risultato di ciascuna
analisi in una multiplex. Anche in questo caso, poiché ciascun
granulo viene analizzato singolarmente, i segnali reporter di ciascun
set di granuli possono essere quantificati in modo preciso.
La tabella che segue mostra i fluorocromi reporter accettabili e la
loro lunghezza d'onda di eccitazione e di emissione.
Volume campione
I volumi campione - o le dimensioni campione - variano da 20 a
200 µL. Accertarsi che del campione rimanga nel pozzetto dopo
l'aspirazione; circa 25 µL in più rispetto al volume campione. Questa
quantità può variare a seconda del tipo di piastra utilizzato. Dopo
l'acquisizione, l'analizzatore Luminex lava le linee campione, il che
produce la riespulsione di circa 160 µL di fluido guaina nel pozzetto.
Accertarsi che ci sia spazio sufficiente per aggiungere questa quantità
al pozzetto senza che gli altri pozzetti trabocchino e vengano
contaminati.
Lunghezze d'onda dei fluorocromi reporter
R-ficoeritrina Alexa 532
Peso formula (Daltons) 240.000 470
Assorbanza max (nm) 480.546.565 531
Estinzione max (M
-1
cm
-1
)
1.960.000 83.800
Emissione max (nm) 578 554
Rendimento quantico 0,82 0,8