Leica Biosystems HER2 FISH System - 30 Test - Manuale (Pagina 9)

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Leica Biosystems Leica HER2 FISH System - 30 Test Istruzioni per l'uso TA9217 IT-CE-Rev_D 08/04/2013
Valutazione ed enumerazione dei segnali
Per valutare la qualità del segnale ed enumerare i segnali HER2 e CEP17, seguite la procedura
sottoindicata:
1. Valutazione della qualità del vetrino
Analizzate la qualità del vetrino usando i seguenti criteri:
• Intensità del segnale della sonda: I segnali devono essere chiari e facili
da valutare. I segnali devono essere di forma ovale, sia compatti e netti
che diffusi e filiformi.
• Fondo: Il fondo deve essere relativamente privo di particelle fluorescenti
ed apparire scuro o nero.
Consultate la guida sulla risoluzione dei problemi (Tabella 6) se qualche
caratteristica tra quelle sopra indicate dovesse risultare poco soddisfacente,
e ripetete l'analisi se necessario.
2. Riconoscimento dei segnali target
Accertatevi che vengano usati i filtri corretti per l'analisi:
• Panoramica del tessuto: I segnali di ibridazione devono essere enumerati
solo tra le cellule tumorali invasive. Le cellule tumorali solitamente si possono
distinguere dalle cellule normali in base alla dimensione: in genere sono più
grandi delle cellule normali, dei linfociti e delle cellule epiteliali. Identificate e
selezionate le aree target mediante colorazione H & E ed evidenziatele sul
vetrino coprioggetti dopo che l'analisi FISH è stata eseguita.
• Profondità del fuoco: Regolate la profondità del fuoco per determinare
la profondità del piano focale e acquistate familiarità con la forma e la
dimensione dei segnali e del rumore target (detriti).
1. Valutare
la qualità del
vetrino
- Intensità del
segnale della
sonda
- Fondo
2. Riconoscere
i segnali target
- Panoramica del
tessuto
- Profondità del
fuoco
3. Idoneità dei
nuclei
- Selezione dei
nuclei
3. Idoneità dei nuclei
Eseguite una panoramica dell'area ibridizzata usando un obiettivo 20X:
• Selezione dei nuclei: Individuate l'area target di interesse (le cellule tumorali
come sono state identificate dalla colorazione H & E). Evitate le aree dove ci
sono cellule necrotiche e dove i bordi nucleari risultano indistinti.
• Inoltre non devono essere considerati i segnali con intensità debole e fondo
aspecifico o elevato, o controcolorazione insufficiente per determinare il
bordo nucleare. Vanno enumerati solo i nuclei con segnali distinti.
4. Enumerazione dei segnali
• Panoramica del tumore: Scansionate numerose aree di cellule tumorali
per giustificare una possibile eterogeneità, usando un obiettivo 40X.
Evitate le aree del target con intensità di segnale debole e selezionate
un'area caratterizzata da una buona distribuzione nucleare.
• Conteggio: Iniziare l’analisi a partire dal quadrante in alto a sinistra
dell’area prescelta e, procedendo da sinistra verso destra, contare il numero
di segnali all'interno del perimetro nucleare, utilizzando un obiettivo 100X,
facendo riferimento alle linee guida indicate di seguito e nella Figura 1.
• Rilevare tutti i segnali presenti nel nucleo variando la profondità del fuoco
(asse Z).
• Contare 2 segnali di dimensioni uguali e separati da una distanza pari o
inferiore al diametro del segnale come un solo segnale.
• I nuclei senza segnali o con segnali di un solo colore non devono essere
contati. Contare solo i nuclei con uno o più segnali FISH di ciascun colore.
• Contare il numero di segnali HER2 e il numero di segnali CEP17 per
ciascun nucleo. Alternate i filtri arancioni (HER2), verdi (CEP17), verdi/
arancioni e DAPI/verde/arancione per vedere entrambi i colori, a seconda
della necessità.
4. Enumerazione
dei segnali
- Panoramica del
tumore
- Conteggio