Luminex xPONENT 3.1 - Manuale (Pagina 17)

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Introduzione
Concentrazione delle microsfere
La concentrazione delle microsfere nell’analisi incide sulla velocità del sistema. Se si
esegue un kit basato su xMAP, seguire le istruzioni del foglietto illustrativo del kit o il
protocollo software fornito. Generalmente si consiglia di utilizzare da 2000 a 5000
microsfere per target, secondo l’analisi.
Misurazioni ripetitive delle microsfere xMAP
In un’analisi xMAP, il segnale reporter è il risultato dell’analisi. A causa delle piccole
dimensioni delle microsfere, la sospensione xMAP mostra una cinetica della reazione
vicina alla fase di soluzione. Ciò significa che ogni insieme di microsfere xMAP utilizzato
per un determinato saggio mostrerà una distribuzione statisticamente uniforme delle
molecole reporter legate alla superficie di ciascun microsfera. Durante l’acquisizione dei
dati, numerosi microsfere di ciascun insieme vengono analizzati e il software calcola la
mediana di tale insieme. Più microsfere sono analizzati in ciascun insieme, più tale
misurazione è affidabile. Se si esegue un kit basato su xMAP, seguire le istruzioni del
foglietto illustrativo del kit o il protocollo software fornito.
Classificazione e fluorocromi reporter
Ciascun insieme di microsfere xMAP è colorato internamente con due tinte di
classificazione. Il segnale di fluorescenza di tali tinte consente la classificazione di ciascun
insieme di microsfere. Poiché ciascun microsfera viene analizzato singolarmente, anche
se le microsfere sono mischiati in analisi multiplex, possono essere comunque distinti dal
proprio segnale di emissione. Il segnale di fluorescenza delle molecole reporter legate alla
superficie di ciascun insieme di microsfere viene misurato e utilizzato per determinare i
risultati di ciascun saggio in un multiplex. Poiché ciascun microsfera viene analizzato
singolarmente, è possibile quantificare accuratamente i segnali reporter di ciascun
insieme di microsfere.
La seguente tabella mostra i flourocromi reporter accettabili e le relative lunghezze d’onda
di eccitazione ed emissione.
Volume campione
I volumi o le dimensioni dei campioni variano in valori compresi tra 10 e 200 µl. Assicurarsi
che un po’ del campione rimanga nel pozzetto dopo l’aspirazione; circa 25 µl in più del
volume del campione. Questa quantità può variare in base al tipo di piastra utilizzata.
Dopo l’acquisizione, l’analizzatore Luminex lava le linee dei campioni dando luogo al
ritorno di circa 165 µl di fluido guaina nel pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Assicurarsi
TABELLA 2. Lunghezze d’onda dei fluorocromi reporter
R-Ficoeritrina Alexa 532
Peso formula (Dalton) 240 000 470
Max assorbanza (nm) 480, 546, 565 531
Max estinzione (M-1 cm-1) 1 960 000 83 800
Max emissione (nm) 578 554
Efficienza quantica 0,82 0,8