Hoefer IEF100 - Manuale (Pagina 61)

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3. SDS equilibrazione soluzione tampone
Questa soluzione viene utilizzata dopo IEF, prima e seconda dimensione
PAGE. Le strisce IPG vengono immersi in soluzione in eccesso per aumen-
tare il pH del tampone striscia in modo che sia adatta per PAGE, e per
rivestire le proteine in SDS uniformemente in modo che la loro migrazione
correttamente nel gel seconda dimensione.
Prepara 200 ml
6 M urea, 75 mM Tris-HCl pH 8,8, 29,3% glicerolo, 2% SDS,
0,002% blu di bromofenolo
Concentrazione finale Quantità
Urea (FW 60,06) 6 M 72,1 g
1.5M Tris-HCl, pH 8,8
soluzione di riserva
75 mM 10,0 ml
Glicerolo (87% w/w) 29,3% (v/v) 69 ml
SDS (FW 288,38) 2% (w/v) 4,0 g
Blu di bromofenolo 0,002% (w/v) 4 mg
Acqua deionizzata a 200 ml
Aliquotare in aliquote da 30 ml e congelare a -20 °C o inferiore.
24 centimetri IPG richiedono 5–10 ml per strip per passo equilibrio. Più
brevi strisce possibile utilizzare il volume proporzionalmente meno per
passo equilibrio.
Procedura di equilibrazione
1 Scongelare due aliquote della soluzione di equilibrazione.
2 Aggiungere 10 mg/ml DTT ad una soluzione.
3 Posizionare le strisce IPG nella reidratazione/equilibrio vassoio.
4 Aggiungere 6,5 ml di soluzione per ciascuno slot contenente una
striscia di IPG.
5 Posizionare il rocker per 10–15 minuti.
Dopo l’equilibrio, scartare la prima soluzione di equilibrio in modo appropriato.
6 Aggiungere 25 mg/ml Iodoacetamide (IAA) alla seconda aliquota di
soluzione di equilibrazione.
7 Aggiungere 6,5 ml di soluzione per ciascuno slot contenente una
striscia di IPG.
8 Inserire il rocker per 10–15 minuti.
Dopo l’equilibrio, scartare la seconda soluzione di equilibrio in
modo appropriato.
Equilibrazione seguito, le strisce IPG sono posizionati sulla sommità del gel
seconda dimensione, e sigillato in posizione con la sovrapposizione agarosio.
Nota: le strisce IPG devono
essere equilibrati poco prima
PAGE dimensin secondo. Non
equilibrare le strisce IPG prima della
conservazione a -20 °C.